เนื้อเยื่อพืช

พรชัย จุฑามาศ
ห้องปฏิบัติการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช
โครงการส่วนพระองค์ สวนจิตรลดา

การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชคือ การนำเอาเซลหรือเนื้อเยื่อหรืออวัยวะบางส่วนของพืช เช่น ยอด ลำต้น ใบ ราก ส่วนต่าง ๆ ของดอกหรือส่วนของผล มาเลี้ยงบนอาหารสังเคราะห์ ซึ่งมีทั้งอาหารกึ่งแข็งและอาหารเหลวในสภาพที่ปลอดเชื้อ

ประโยชน์ของการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช

ในปัจจุบันได้มีการนำเอาเทคนิคการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชไปประยุกต์ใช้กับงานด้านต่าง ๆ เช่น ทางด้านการเกษตร พฤกษศาสตร์ ชีวเคมี เภสัชศาสตร์ โดยทางด้านการเกษตรนำไปใช้ทางด้านปรับปรุงพันธุ์ คัดเลือกพันธุ์พืชให้ได้พืชที่ทนต่อโรค แมลง ยากำจัดวัชพืชหรือทนต่อดินเค็ม การขยายพันธุ์พืชให้ได้ประมาณมากในระยะเวลาอันรวดเร็ว ไม่กลายพันธุ์ การเก็บรักษาพันธุ์พืช ซึ่งการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชนี้สามารถที่จะประหยัดเวลาแรงงาน งบประมาณเมื่อเปรียบเทียบกับการวิจัยแบบเดิมที่ทำมา

ห้องปฏิบัติการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช

ห้องปฏิบัติการประกอบด้วยส่วนสำคัญ 3 ส่วนคือ
1. ห้องเตรียมอาหาร ควรเป็นห้องที่มีโต๊ะสำหรับเตรียมสารเคมี อ่างน้ำ ตู้เย็น สำหรับเก็บสารละลายเข้มข้น เครื่องชั่ง เครื่องวัดความเป็นกรด-ด่าง เตาหลอมอาหาร หม้อนึ่งฆ่าเชื้อจุลินทรีย์แบบความดันไอน้ำ
2. ห้องถ่ายเนื้อเยื่อ เครื่องมือสำคัญในห้องนี้คือ ตู้สำหรับเลี้ยงหรือถ่ายเนื้อเยื่อเป็นตู้ที่มีอากาศถ่ายเทผ่านแผ่นกรอง ที่สามารถกรองจุลินทรีย์ไว้ได้ตลอดเวลา ทำให้อากาศภายในตู้บริสุทธิ์ ช่วยให้ทำงานสะดวกรวดเร็ว
3. ห้องเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช สภาพแวดล้อมที่เหมาะสมในการเลี้ยงเนื้อเยื่อจะแตกต่างกันสำหรับพืชแต่ละชนิด โดยทั่วไปมักจะปรับสภาพแวดล้อมภายในห้องให้มีอุณหภูมิประมาณ 25 องศาเซลเซียส ระยะเวลาที่ให้แสงประมาณ 12-16 ชั่วโมง/วัน ความเข้มของแสง 1,000-3,000 ลักซ์
การดูแลห้องเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชจะต้องสะอาดอยู่เสมอ หมั่นตรวจดูขวดหรือภาชนะที่เลี้ยงเนื้อเยื่อพืช ถ้าพบว่ามีจุลินทรีย์ขึ้นปะปน จะต้องรีบนำออกไปต้มฆ่าเชื้อและล้างทันทีไม่ให้เป็นที่สะสมเชื้อจุลินทรีย์ ซึ่งอาจแพร่กระจายภายในห้องได้

อุปกรณ์ในการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช

1. พันธุ์พืชที่จะนำมาเพาะเลี้ยง ควรสะอาด ปราศจากโรคและเป็นส่วนที่สำคัญที่ยังอ่อนอยู่ เช่น ตาเป็นอวัยวะที่ดีที่สุด ส่วนใบ ดอก ราก ก็สามารถนำมาเลี้ยงได้
2. เครื่องแก้วต่าง ๆ ได้แก่ ฟลาสค์ บีคเกอร์ ปิเปตต์ จานเพาะเชื้อ กระบอกตวง ขวด สำหรับเลี้ยงเนื้อเยื่อ
3. สารเคมีต่าง ๆ
     3.1 สารเคมีที่ใช้ฆ่าเชื้อที่ติดมากับผิวพืช เช่น คลอรอกซ์ เอททิลแอลกอฮอล์ เมอคิวริคคลอไรด์ ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์
     3.2 สารเคมีที่ใช้เตรียมสูตรอาหารต่าง ๆ
     3.3 สารเคมีที่ควบคุมการเจริญเติบโต
     3.4 น้ำตาลซูโครส
     3.5 วุ้น
4. เครื่องมือผ่าตัด ได้แก่ มีดผ่าตัด ปากคีบ
5. ตู้ถ่ายเนื้อเยื่อ
6. อุปกรณ์เบ็ดเตล็ดต่าง ๆ

อาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ

ความสำเร็จในการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชขึ้นอยู่กับปัจจัยหลายอย่าง สิ่งที่สำคัญมากอย่างหนึ่งคือองค์ประกอบของอาหารที่เหมาะสม ซึ่งต้องประกอบด้วยอาหารที่พืชสามารถนำไปใช้อย่างมีประสิทธิภาพ สูตรอาหารเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช ประกอบด้วยส่วนต่าง ๆ ดังนี้
- สารอนินทรีย์
- สารประกอบอินทรีย์
- สารที่ได้จากธรรมชาติ
- สารไม่ออกฤทธิ์
1. สารอนินทรีย์ ได้แก่ ธาตุอาหารหลักคือ ธาตุอาหารที่พืชจำเป็นต้องใช้ในปริมาณมาก เช่น ไนโตรเจน ฟอสฟอรัส โปแตสเซียม กำมะถัน แคลเซียม แมกนีเซียม และธาตุอาหารรองหรือธาตุอาหารที่พืชจำเป็นใช้ในปริมาณน้อย เช่น แมงกานีส สังกะสี ทองแดง โมลิบดีนัม โบรอน ไอโอดีน โคบอล คลอรีน
2. สารประกอบอินทรีย์ แบ่งออกได้หลายพวกคือ
     2.1 น้ำตาล
     2.2 ไวตามิน ชนิดที่มีความสำคัญ ได้แก่ ไธอะมีน
     2.3 อมิโนแอซิด เช่น ไกลซีน
     2.4 สารควบคุมการเจริญเติบโต ได้แก่ ออกซิน ไซโตไคนิน จิบเบอเรลลิน
     2.5 สารอินทรีย์พวกอิโนซิทอล อะดีนีน ช่วยส่งเสริมให้เกิดยอด ซีดริคหรือแอสคามิคแอซิดช่วยลดสีน้ำตาลที่บริเวณชิ้นส่วนพืช
3. สารที่ได้จากธรรมชาติ เช่น กล้วยบด น้ำมะพร้าว น้ำส้มคั้น น้ำมะเขือเทศ
4. สารไม่ออกฤทธิ์ เช่น วุ้นช่วยให้พืชอยู่ได้ ผงถ่านช่วยดูดซับสารพิษที่พืชสร้างออกมาและเป็นพิษกับพืชเอง

การเตรียมสารละลายเข้มข้น

การเตรียมอาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช จะไม่เตรียมโดยการชั่งสารเคมีในแต่ละครั้งที่เตรียม แต่จะเตรียมเป็นสารละลายเข้มข้นคือ การรวมสารเคมีพวกที่สามารถรวมกันได้โดยไม่ตกตะกอนไว้ด้วยกัน
วิธีการเตรียมเริ่มจากชั่งสารเคมีตามจำนวนที่ต้องการ ละลายสารแต่ละชนิดให้หมดก่อนแล้วจึงนำมาผสมกัน เติมน้ำกลั่นให้ได้ปริมาตรที่ต้องการ กวนให้เข้ากัน แล้วจึงบรรจุลงในขวดสารละลาย ลงรายละเอียดชนิดของสาร ความเข้มข้น วันเดือนปี ปริมาตร แล้วเก็บในตู้เย็น

วิธีการเตรียมอาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช

1. นำสารละลายเข้มข้นชนิดต่าง ๆ มาผสมกัน ค่อย ๆ กวนให้เข้ากันจนหมดครบทุกชนิด
2. เติมน้ำตาล แล้วเติมน้ำกลั่นให้ได้ปริมาตรที่ต้องการ ปรับ pH 5.6-5.7
3. นำวุ้นผสมกับอาหารที่เตรียม หลอมวุ้นให้ละลาย
4. บรรจุลงในขวดอาหารในปริมาตรเท่า ๆ กัน ปิดฝาให้สนิท

การฆ่าเชื้อจุลินทรีย์

1. การฆ่าเชื้อจุลินทรีย์ในอาหาร นำขวดที่บรรจุอาหารแล้วไปนึ่งฆ่าเชื้อด้วยหม้อนึ่งความดันไอน้ำที่อุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส ความดัน 15 ปอนด์/ตารางนิ้ว เป็นเวลา 15-20 นาที
2. การฆ่าเชื้อจุลินทรีย์บริเวณภายนอกชิ้นส่วนพืช เป็นสิ่งจำเป็นและสำคัญที่จะต้องฆ่าเชื้อจุลินทรีย์ที่ติดมากับบริเวณผิวนอกของชิ้นส่วนพืช เนื่องจากอาหารที่ใช้เพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชมีธาตุอาหารและไวตามิน ที่จุลินทรีย์ต่าง ๆ เจริญได้ดีและรวดเร็วกว่าเนื้อเยื่อพืช การฆ่าเชื้อจุลินทรีย์ที่ทำได้สะดวกและได้ผลดี โดยการใช้สารเคมีชนิดที่สามารถฆ่าเชื้อจุลินทรีย์ได้หมดทุกชนิด และล้างออกได้ง่าย เพราะถ้าล้างออกได้ยาก สารเคมีเหล่านี้จะมีผลทำให้เนื้อเยื่อพืชตาย หรือมีการเจริญเติบโตไม่ดีเท่าที่ควร
การเติมน้ำยาซักฟอกลงไปในสารเคมีที่ใช้ฆ่าเชื้อจุลินทรีย์ จะทำให้ประสิทธิภาพสารเคมีเหล่านั้นดีขึ้น เนื่องจากจะทำให้ลดแรงตึงผิวบริเวณผิวนอกของชิ้นส่วนพืช สารเคมีจะแทรกซึมเข้าไปทำลายจุลินทรีย์ตามซอกต่าง ๆ ได้ดีขึ้น การเตรียมสารเคมีฆ่าเชื้อจุลินทรีย์ทำโดยตวงสารให้ได้ปริมาตรตามที่ต้องการ แล้วเติมน้ำกลั่นที่นึ่งฆ่าเชื้อและน้ำยาซักฟอกลงไป เขย่าให้เข้ากัน การเตรียมนี้ควรเตรียมใหม่ทุกครั้งที่ใช้

วิธีการเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช

1. นำชิ้นส่วนพืชที่ต้องการมาล้างน้ำให้สะอาด
2. ตกแต่งชิ้นส่วนพืช ตัดส่วนที่ไม่ต้องการออก
3. นำชิ้นส่วนพืชจุ่มในแอลกอฮอล์ 95% เพื่อลดแรงตึงผิวบริเวณนอกชิ้นส่วนพืช
4. นำชิ้นส่วนพืชมาเขย่าในสารฆ่าเชื้อจุลินทรีย์ที่เตรียมไว้นาน 10-15 นาที
5. ใช้ปากคีบคีบชิ้นส่วนพืช ล้างในน้ำกลั่นที่นึ่งฆ่าเชื้อ 3 ครั้ง
6. ตัดชิ้นส่วนพืชตามขนาดที่ต้องการแล้ววางบนอาหารสังเคราะห์
7. ลงรายละเอียด เช่น ชนิดพืช วันเดือนปี หรือรหัส
ในการทำการฆ่าเชื้อที่ติดมากับผิวพืชและการนำไปเลี้ยงบนอาหาร ทำในตู้ถ่ายเนื้อเยื่อโดยตลอด

การดูแลเนื้อเยื่อระหว่างการเลี้ยง

นำขวดเลี้ยงเนื้อเยื่อไปวางบนชั้นในห้องเลี้ยงเนื้อเยื่อ โดยปรับสภาพแวดล้อมให้เหมาะสมโดยทั่วไปปรับอุณหภูมิภายในห้องประมาณ 25 องศาเซลเซียส ระยะเวลาที่ให้แสงประมาณ 12-16 ชั่วโมง/วัน ความเข้มของแสง 1,000-3,000 lux
เนื้อเยื่อพืชที่เลี้ยงควรเปลี่ยนอาหารใหม่ทุก 2 สัปดาห์ ระหว่างการเลี้ยงตรวจดูการเจริญเติบโตสังเกตการเปลี่ยนแปลง บันทึกรายงานได้เพื่อเป็นข้อมูล

การย้ายพืชออกจากขวดเลี้ยงเนื้อเยื่อเพื่อลงปลูกในกระถาง

เมื่อพืชเจริญเติบโตเป็นต้นที่สมบูรณ์แล้วก็นำไปลงปลูกในกระถางดังนี้
1. เตรียมทราย : ถ่านแกลบ หรือทราย : ขุยมะพร้าว อัตราส่วน 1:1 ใส่กระถางหรือกระบะพลาสติก
2. ใช้ปากคีบ คีบต้นพืชออกจากขวดอย่างระมัดระวัง
3. ล้างเศษวุ้นที่ติดอยู่บริเวณรากออกให้หมด
4. จุ่มยากันรา ตามอัตราส่วนที่กำหนดในสลากยา
5. ปลูกในกระถางหรือกระบะ
6. นำไปไว้ในตู้ควบคุมความชื้น แสง อุณหภูมิ หรือนำไปไว้ในกระบะพ่นหมด เมื่อพืชเจริญตั้งตัวดีแล้วจึงย้ายลงแปลงปลูกต่อไป

เอกสารอ้างอิง

1. ไพบูลย์ กวินเลิศวัฒนา. 2524. หลักและวิธีการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช. 109 หน้า
2. ยุพา มงคลสุข. 2527. เทคนิคการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช (โรเนียว) 22 หน้า
3. อรดี สหวัชรินทร์. 2527. เทคนิคการเพาะเลี้งเนื้อเยื่อพืช. 17 หน้า
4. Street. H.E. 1977. Plant Tissue and Cell Culture University of California press. 613 oo,
5. Thrope T.A. 1981. Plant Tissue C\culture Metnods and Application in Agiculture Academe press. 379 pp.

จัดทำโฮมเพจโดย : สำนักบริการคอมพิวเตอร์, 7 มิถุนายน 2544